En 1940 pasó a afincarse en los Estados Unidos .En 1941 consigue trabajo en la Universidad Washington de San Luis y en 1945 en la Universidad de Nueva York. Ochoa se dedicó a realizar investigaciones sobre farmacología y bioquímica que le valieron la medalla Bewberg en 1951. En 1954, prosiguiendo con sus trabajos sobre la fosforilación oxidativa, descubrió una enzima, la polinucleótido fosforilasa, capaz de sintetizar ARN in vitro a partir de ribonucleosidodifosfatos.
En 1955 Ochoa publicó en Journal of the American Chemical Society con la bioquímica Marianne Grunberg-Manago, el aislamiento de una enzima del colibacilo que cataliza la síntesis de ARN, el intermediario entre el ADN y las proteínas.
El matrimonio Ochoa se nacionalizó estadounidense en 1956, conservando la doble nacionalidad española y estadounidense durante toda su vida.
A partir de 1964 Severo Ochoa se adentró, por una parte, en los mecanismos de replicación de los virus que tienen ARN como material genético, describiendo las etapas fundamentales del proceso, y, por otra parte, en los mecanismos de síntesis de proteínas, con especial atención al proceso de iniciación, tanto en organismos procarióticos como en eucarióticos, siendo pionero en el descubrimiento de los factores de iniciación de la traducción. España quiso recuperar su magisterio, y al efecto en 1971 se creaba para él en Madrid el Centro de Biología Molecular. En 1974 se trasladó como Investigador Distinguido al Instituto Roche de Biología Molecular en Nueva Jersey. Se jubiló en la Universidad de Nueva York en 1975.
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