Aportes al ciclo krebs

Investigaciones y premios nobel

La polinucleótido fosforilasa

Desciframiento del código genético

Utilización de homopolímeros

Premio nobel e investigaciones

El grupo 2 está realizando una presentación en google docs sobre las investigaciones de Severo Ochoa

Desciframiento del código genético

TÉCNICA DE INCORPORACIÓN DE ARN TRASNFERENTES

En esta técnica se utilizan ARN mensajeros sintéticos de secuencia conocida con la siguiente estructura: los grupos de Khorana y Nirenberg emplearon trinucleótidos, mientras que el equipo de Matthei utilizaba oligonucleótidos del tipo ABCCCCCCCCCCC.... (el tercer nucleótido estaba repetido 100 veces). En este último caso solamente se analiza en primer triplete, ABC.

En todos los casos, en lugar de analizar los polipéptidos sintetizados, se analiza la especificidad con que el ARN transferente (ARN-t) con o sin su aminoácido correspondiente se incorpora al ribosoma. Dicha especificidad viene determinada por la secuencia de ribonucleótidos del ARN-m sintético empleado.

Para averiguar el ARN-t que es capaz de unirse en el ribosoma al trinucleótido analizado, es necesario marcar radiactivamente uno de los ARN-t de todos los utilizados. Se lleva a cabo esta operación marcadndo radiactivamente cada vez un ARN-t distinto.

Con este sistema fue posible descifrar todos los tripletes que aún no habían sido descifrados.

Desciframiento del código genético

USO DE COPOLÍMEROS

El siguiente paso fue la utilización de copolímeros, es decir, de ARN sintéticos que contenían más de un más de un ribonucleótido distinto. Para ello emplearon la Polirribonucleótido fosforilasa y pusieron en el medio dos ribonucleósidos distintos. Por ejemplo, U y G, de manera que había 5 veces más U que G en el medio (5U:1G). Debido a que el enzima toma los ribonucleósidos difosfato del medio al azar, la probabilidad de que tome un U del medio es 5/6, mientras< que la probabilidad de que tome una G es 1/6. El ARN sintético formado presentaba una secuencia al azar de uracilos y guaninas y aparecían en él ocho tripletes diferentes con las siguientes probabilidades:

Triplete 5’→ 3’	Probabilidad	Valor relativo
UUU	5/6 x 5/6 x 5/6 = 125/216	100
UUG	5/6 x 5/6 x 1/6 = 25/216	20
UGU	5/6 x 1/6 x 5/6 = 25/216	20
GUU	1/6 x 5/6 x 5/6 = 25/216	20
UGG	5/6 x 1/6 x 1/6 = 5/216	4
GUG	1/6 x 5/6 x 1/6 = 5/216	4
GGU	1/6 x 1/6 x 5/6 = 5/216	4
GGG	1/6 x 1/6 x 1/6 = 1/216	0,08

Cuando se analizó el polipéptido que se sintetizaba con este mensajero sintético, se observó que contenía fenilalanina (phe), cisteina (cys), valina (val), glicina (gly) y triptófano (trp). Tomando como valor 100 el de el aminoácido más frecuente, cys y val presentaban un valor de 20 mientras que trp y gly mostraban un valor de 4 a 5. Se confirmaba que UUU significaba fenilalanina y se deducía que 2U y 1G (UUG, UGU y GUU) codificaban para cisteína y valina. También se deducía que 1U y 2G (UGG, GUG y GGU) codificaban para triptófano y glicina. Sin emabrgo, no era posible asignar un triplete concreto para cisteína y valina, o para triptófano y glicina. Parece raro, que en estos experimentos no detectaran el aminoácido leucina (leu) que esta codificado por el triplete UUG, tampoco dedujeron que el aminoácido valina estaba codificado por 1U y 2 G (GUG). Uno e los problemas, de estos experimentos radica en asignar el valor 100 al aminoácido más frecuente y comparar las proporciones de aminoácidos obtenidas de esta manera con las de los distintos tripletes del mensajero, ya que el aminoácido más frecuente puede estar codificado por más de un triplete. Oto inconveniente es que los mensajeros sintéticos producidos no presenten la frecuencia de codones esperada por azar.

Este tipo de experimentos fueron realizados por los grupos de Nirenberg y de Ochoa y no rindieron grandes resultados.

Desciframiento del código genético

UTILIZACIÓN DE HOMOPOLÍMEROS

Un homopolímero es un ARN sintético que solamente contiene un tipo de ribonucleótido. Por ejemplo, el ARN sintético UUUUUUUUUUUUU.......

Gruberg-Manago y Ochoa (1955) aislaron a partir de timo de ternera un ezima denominada Polirribonucleótido fosforilasa que tenía la capacidad de sintetizar ARN a partir de ribonucleósidos difosfato y sin necesidad de molde. Este enzima iba tomando al azar los ribonuclkeñosidos del medio para originar un ARN.

Matthei y Nirenberg (1961) consiguieron sintetizar polipéptidos "in vitro" añadiendo un ARN sintético de secuencia conocida a un sistema acelular estable de traducción. Usando la Polirribonucleótido fosforilasa sintetizaron poli-uridílico (poli-U: UUUUUUUUUUUUUU...). Cuando emplearon este ARN sintético en su sistema acelular de traducción daba lugar a la formación de un polipéptido que solamente contenía el aminoácido fenilalanina (Poli-fenilalanina: phe-phe-phe-phe-..). Por tanto, el triplete UUU codificaba para fenilalanina (phe). También comprobaron que el ARN síntético Poli C (Poli-citidílico: CCCCCCCCCC....) daba lugar a un polipéptido que contenía solamente prolina (Poli-prolina: pro-pro-pro-pro-pro-...), por tanto, el codón CCC significaba prolina (pro).

Poco tiempo después, Ochoa sintetizó Poli-adenílico (Poli-A: AAAAAAAAA....) y observó que el polipéptido que aparecía solamente tenía el aminoácido lisina (Poli-lisina: lys-lys-lys-lys-....). Por consiguiente el triplete AAA codificaba para el aminoácido lisina (lys). También corroboró que el Poli-C daba lugar a Poli-prolina. El ARN Poli-guanílico no producía proteína alguna, probablemente debido a que adquiría una estructura terciaría helicoidal que impedía su traducción a proteína.

Aportes al ciclo de Krebs

Una de sus investigaciones tuvo lugar mediante trabajos de enzimología metabólica con el descubrimiento de dos enzimas, la citrato-sintetasa y la piruvato-deshidrogenasa, que permitieron concluir el conocimiento efectivo del ciclo de Krebs(Que trata de una sucesión de reacciones químicas, que forma parte de la respiración celular en todas las células aeróbicas) y que representa un proceso biológico fundamental en el metabolismo de los seres vivos.

LA POLINUCLEÓTIDO FOSFORILASA

Tras sus importantes contribuciones al mejor conocimiento de la glicólisis, el ciclo de Krebs, la fosforilación oxidativa, la fotosíntesis y el metabolismo de los ácidos grasos, llega el descubrimiento de la polinucleótido fosforilasa. En 1955 Ochoa publicó, con la bioquímica francorrusa Marianne Grunberg-Manago, el aislamiento de una enzima del colibacilo que cataliza la síntesis de ARN, el intermediario entre el ADN y las proteínas. Los descubridores llamaron «polinucleótido-fosforilasa» a la enzima, conocida luego como ARN-polimerasa. Ochoa vio rápidamente la trascendencia de estos trabajos y más tarde lo explicó de este modo: “Una enzima aislada del microorganismo Azotobacter vinelandii, cataliza la síntesis de polinucleótidos altamente polimerizados a partir de los 5'-nucleósidos difosfato con liberación de ortofosfato....Fácil es imaginar mi emoción cuando me di cuenta de lo que realmente ocurría.” Un polímero de alto peso molecular, análogo al ARN, había sido sintetizado por primera vez fuera de la célula, mediante una reacción enzimática. En 1956, el norteamericano A. Kornberg, otro discípulo de Ochoa, demostró que el ADN se sintetiza igualmente mediante su polimerasa. Ambos compartieron el premio Nobel en su edición de 1959 por sus respectivos hallazgos, que supusieron un avance enorme, pues ya se podía intentar el descifrar el código genético.

Premio Nobel en 1959 junto a Kornberg

Así, el día 15 de Octubre de 1959, a la una de la tarde, en el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva York se recibía, desde Estocolmo, un telegrama dirigido al profesor Severo Ochoa, que decía literalmente :

"La universidad de Carolina ha decidido otorgar este año el Premio Nobel en Fisiología y Medicina compartido por ti y por el profesor Arthur Kornberg por vuestros descubrimientos del mecanismo en las síntesis biológicas del ácido ribonucleico y ácido desoxirribonucleico. Sten Friberg. Rector of the Caroline Institute".

Este premio, lejos de significar la meta final de sus ambiciones científicas, le estimuló para que en cinco años, en dura competencia con los laboratorios de Marshall Nirenberg y de Gobind Khorana, lograra el completo desciframiento de la clave genética. Para ello, fue esencial la utilización de la polinucleótido fosforilasa, auténtica "Piedra de Rosetta" del Código Genético. Por este descubrimiento, la llave que abrió las puertas de la Ingeniería Genética, de las técnicas de clonación y más recientemente, del nacimiento de Dolly, la primera oveja clonada, los Dres. Nirenberg y Khorana recibieron el Premio Nobel de Medicina, en 1968. Ochoa mereció pues compartir ese premio, que hubiera significado su segundo Premio Nobel. Llegado ese momento, el ansia por investigar, que para Ochoa era "arrancarle secretos a la vida", no cesó y continuó estudiando los mecanismos de la expresión génica de los virus ARN, la biosíntesis de proteínas en bacterias y finalmente, la regulación de la síntesis de proteínas en células superiores.