En esta técnica se utilizan ARN mensajeros sintéticos de secuencia conocida con la siguiente estructura: los grupos de Khorana y Nirenberg emplearon trinucleótidos, mientras que el equipo de Matthei utilizaba oligonucleótidos del tipo ABCCCCCCCCCCC.... (el tercer nucleótido estaba repetido 100 veces). En este último caso solamente se analiza en primer triplete, ABC.
En todos los casos, en lugar de analizar los polipéptidos sintetizados, se analiza la especificidad con que el ARN transferente (ARN-t) con o sin su aminoácido correspondiente se incorpora al ribosoma. Dicha especificidad viene determinada por la secuencia de ribonucleótidos del ARN-m sintético empleado.
Para averiguar el ARN-t que es capaz de unirse en el ribosoma al trinucleótido analizado, es necesario marcar radiactivamente uno de los ARN-t de todos los utilizados. Se lleva a cabo esta operación marcadndo radiactivamente cada vez un ARN-t distinto.
Con este sistema fue posible descifrar todos los tripletes que aún no habían sido descifrados.
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