Tras sus importantes contribuciones al mejor conocimiento de la glicólisis, el ciclo de Krebs, la fosforilación oxidativa, la fotosíntesis y el metabolismo de los ácidos grasos, llega el descubrimiento de la polinucleótido fosforilasa. En 1955 Ochoa publicó, con la bioquímica francorrusa Marianne Grunberg-Manago, el aislamiento de una enzima del colibacilo que cataliza la síntesis de ARN, el intermediario entre el ADN y las proteínas. Los descubridores llamaron «polinucleótido-fosforilasa» a la enzima, conocida luego como ARN-polimerasa. Ochoa vio rápidamente la trascendencia de estos trabajos y más tarde lo explicó de este modo: “Una enzima aislada del microorganismo Azotobacter vinelandii, cataliza la síntesis de polinucleótidos altamente polimerizados a partir de los 5'-nucleósidos difosfato con liberación de ortofosfato....Fácil es imaginar mi emoción cuando me di cuenta de lo que realmente ocurría.” Un polímero de alto peso molecular, análogo al ARN, había sido sintetizado por primera vez fuera de la célula, mediante una reacción enzimática. En 1956, el norteamericano A. Kornberg, otro discípulo de Ochoa, demostró que el ADN se sintetiza igualmente mediante su polimerasa. Ambos compartieron el premio Nobel en su edición de 1959 por sus respectivos hallazgos, que supusieron un avance enorme, pues ya se podía intentar el descifrar el código genético.
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